Qual A Etapa Que Precisamos Realizar Antes De Iniciarmos A PCR Em Tempo Real?
A tecnologia de PCR em Tempo Real (qPCR) é uma evolução do método de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase). Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.
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Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
A elevada sensibilidade dessa técnica possibilita excelentes resultados, porém também está sujeita a presença de inibidores e contaminação que podem afetar a sua eficiência. Os plásticos para qPCR tem um grande impacto sobre os ensaios em tempo real e precisam receber um tratamento especial para não interferir na reação, principalmente na leitura do sinal fluorescente. Ocasionam assim um resultado errado, com baixa concentração ou mesmo inviabilizando o processo.
Efficiency, R2, precision, and sensitivity are used to determine performance of a PCR reaction when comparing different reaction conditions. For a rigorous evaluation, all factors listed in Table 1 must be evaluated together. In addition to these factors, proper experimental controls (such as no template control, no RT control) and template quality must be evaluated and validated.
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Como esses testes são realizados seguindo uma metodologia, materiais e maquinário específico, eles precisam ser feitos por laboratórios e mão de obra especializada, e, por isso, ainda não estão disponíveis em laboratórios convencionais.
As baixas temperaturas do inverno e o confinamento das pessoas em ambientes fechados e pouco ventilado também estão afetando a qualidade de vida da população. Muitos enfrentam problemas respiratórios, que se intensificam nessa época do ano, e os vírus encontram ambientes propícios para seu desenvolvimento, além da vasta gama de bactérias que também acometem o trato respiratório.
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Saiba mais sobre o DNA em: Genética: o que é o DNA, o genoma e o que são genes?
The standard deviation (square root of the variance) is the most common measure of precision. If many data points are close to the mean, the standard deviation is small; if many data points are far from the mean, the standard deviation is large.
qPCR – PCR em Tempo Real
A PCR foi desenvolvida no final dos anos 80 por Kary Mullis que posteriormente ganhou o Prêmio Nobel de Química pelo feito. Além de revolucionar as técnicas de genética molecular, sua aplicação compreende várias áreas como identificação genética, medicina forense, análises clínicas, diagnóstico de doenças, controle de qualidade industrial, entre outros.
Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.
Ct (threshold cycle) is the intersection between an amplification curve and a threshold line (Figure 1B). It is a relative measure of the concentration of target in the PCR reaction. Many factors impact the absolute value of Ct besides the concentration of the target. We will discuss the most common template-independent factors that can influence Ct and describe how to evaluate the performance of a real-time PCR reaction.
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Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado.
Dessa forma, a PCR em tempo real é mais indicada para lidar com patógenos virais, como a Sars-CoV-2 – um vírus de RNA. Já que o processo é muito mais rápido que a cultura viral e muito mais sensível que os testes de antígenos.
De maneira simples e resumida, essa reação parte da enzima DNA-polimerase que sintetiza um oligonucleotídeo, ou primer, previamente selecionado, para então se unir ao DNA alvo e, assim, conseguir complementar o DNA de interesse.
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To properly evaluate PCR efficiency, a minimum of 3 replicates and a minimum of 5 logs of template concentration are necessary. The reason for this suggested level of rigor is illustrated in Figure 6, which demonstrates the possible mathematical variation of slope or efficiency obtained when testing dilutions over 1 log vs. 5 logs. Thus, even if the assay is 100% efficient, a range from 70 to 170% can be obtained when testing a dilution series of a single log, due to the standard deviation in one dilution. For the same number of dilutions or replicates on a 5-log range, the potential artifact is only ±8 %. That means for 94% efficiency on a 5-log range, the assay would have a range of 88% to 100% efficiency. To accurately determine the efficiency of a PCR reaction, a 5-log dilution series must be performed. A slope of –3.3 ±10% reflects an efficiency of 100% ±10%. A PCR reaction with lower efficiency will have lower sensitivity.
Any system capable of effectively amplifying and detecting one copy of starting template has achieved the ultimate level of sensitivity, regardless of the absolute value of the Ct.
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Figure 1, above, shows several parameters of the real-time reaction amplification plot. The exponential phase in Figure 1B corresponds to the linear phase in Figure 1C. The threshold must be set in the linear phase of the amplification plot in Figure 1C. The Ct value increases with a decreasing amount of template. However, artifacts from the reaction mix or instrument that change the fluorescence measurements associated with the Ct calculation will result in template-independent changes to the Ct value. Therefore, the Ct values from PCR reactions run under different conditions or with different reagents cannot be compared directly.
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Essa técnica molecular também é utilizada na oncologia para identificação do cromossomo Philadeplhia, uma alteração citogenética que está associada a algumas formas de leucemia.
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E para que o diagnóstico seja feito de forma rápida e confiável, os médicos estão incluindo o qPCR como teste essencial – até mesmo para poder diferenciar a infecção viral e, assim, ser mais preciso e assertivo no seu diagnóstico, uma vez que os sintomas das infecções são muitos semelhantes.
A Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction), também conhecido como PCR, foi apresentado oficialmente no periódico científico Science, em 1985.
Another critical parameter to evaluating PCR efficiency is R2, which is a statistical term that indicates how good one value is at predicting another. When R2 is 1, the value of Y (Ct) can be used to accurately predict the value of (Figure 7A). If R2 is 0, the value of X cannot be predicted from the value of Y (Figure 7B). An R2 value >0.99 provides good confidence in correlating two values.
Qual é a sequência correta das etapas do PCR?
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes.
- 1 – Desnaturação. O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. ...
- 2 – Anelamento ou hibridização. ...
- 3 – Extensão ou polimerização.
Qual é o princípio da técnica de PCR?
Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.
Qual a função da enzima Taq polimerase?
A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94°C). ... Este tipo de atividade enzimática permite a outras polimerases corrigir a introdução de um nucleótido errado na cadeia de DNA nascente.
O que é uma polimerase?
Polimerase é uma enzima que catalisa a reação de polimerização de ácidos nucleicos a partir dos seus monômeros. As polimerases mais comuns são a RNA polimerase e a DNA polimerase. Para a duplicação celular acontecer, a DNA polimerase, permite a ligação de nucleotídeos novos ao molde de DNA.
Qual a utilidade diagnóstica da reação em cadeia da polimerase?
A Reação em Cadeia da Polimerase – PCR – tem sido uma ferramenta aliada a medicina na pesquisa, diagnóstico e monitoramento de diferentes tipos de doenças. Também, é uma ferramenta utilizada para a determinação de características genéticas individuais e em análises forenses.
Qual a importância da PCR para diagnóstico de doenças?
O PCR facilita o diagnóstico de doenças complexas e a identificação de patógenos que possuem potencial zoonótico e aqueles com crescimento in vitro extremamente lentos ou fastidiosos.
Como a PCR pode contribuir no diagnóstico de doenças?
Alguns exemplos de sua aplicação consistem no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs , anteriormente chamada de DSTs , e meningites. É utilizada também no diagnóstico de doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças, como é o caso da trombose.
O que é a técnica de eletroforese?
A eletroforese é um método habitualmente usado para separar e também purificar macromoléculas, principalmente ácidos nucleicos e proteínas. Essas macromoléculas são submetidas a um campo elétrico, na qual migram para um polo positivo ou negativo de acordo com a sua carga.
Como é realizado a eletroforese?
A eletroforese de hemoglobina é feita a partir da coleta de uma amostra de sangue por um profissional capacitado em laboratório especializado, isso porque a coleta incorreta pode resultar em hemólise, ou seja, destruição das hemácias, o que pode interferir no resultado.
Como funciona a eletroforese capilar?
Na eletroforese capilar, o capilar é preenchido com uma solução tampão e suas extremidades são mergulhadas em recipientes, que contém a solução tampão, e onde é aplicado um campo elétrico, que gera uma corrente no interior do capilar.